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抑制AKT/mTOR通路可以增强索拉非尼在甲状腺癌中的作用【图】

2020-01-15 10:30:11

  分化型甲状腺癌(DTC)占所有甲状腺肿瘤的95%左右。放射性碘治疗作为其重要治疗措施,目前在临床上应用广泛,但是在发生转移的情况下,超过半数的患者会发展成为放射性碘难治性DTC。索拉非尼是一种多激酶抑制剂,已被批准用于治疗放射性碘难治的进展期DTC。然而,此类患者的无进展生存期(PFS)仍然较短,且多数患者最终会出现耐药。因此,探索新的治疗方法就显得尤为重要。

  DTC发生与RAS基因突变相关:RAS基因突变会激活MAPK通路及PI3K/AKT/mTOR通路,并且在DTC中可能会优先激活PI3K/AKT/mTOR通路。这两种通路激活都会导致甲状腺癌恶性程度增高,而且会导致患者对抗肿瘤治疗耐药。已有临床研究证实,AKT磷酸化水平更低的患者对索拉非尼的应答率更高,提示索拉非尼治疗的预后与PI3K/AKT/mTOR通路密切相关。然而,其中的关系和具体机制尚不明确。

  因此,来自浙江省肿瘤医院的研究团队通过设计细胞实验对索拉非尼与PI3K/AKT/mTOR通路之间的关系及可能机制展开了探索,以期为DTC的治疗提供新的思路。


  实验设计

  选取细胞系为人甲状腺癌细胞系8505C和FTC133,用不同浓度索拉非尼作用不同时间,同时应用siRNA干扰技术及抑制剂BEZ235(PI3K和mTOR共同的抑制剂)来抑制AKT通路,观察各组合效果。

干扰效率用AKT转录(mRNA水平,通过qRT-PCR检测)及蛋白翻译(磷酸化的AKT、p70s6k,用western blot检测)水平来验证。p70s6k为mTOR重要下游分子。通路中重要分子(AKT、p70s6k或ERK)的磷酸化水平代表通路激活情况,本研究中,磷酸化水平越高代表激活越明显。

  用CCK8试剂盒来检测细胞增殖情况和存活率,用膜联蛋白v(Annexin-V)和碘化丙啶染色,再用流式细胞仪来检测细胞凋亡。

 

  实验结果

  1 索拉非尼可以有效抑制甲状腺癌细胞增殖,促进甲状腺癌细胞凋亡

  在8505C和FTC133细胞系中用不同浓度的索拉非尼作用不同时间,可以发现,在剂量高于5uM时,索拉非尼可以有效抑制甲状腺癌细胞增殖,这种抑制作用呈现出时间及剂量依赖趋势。同时,随着索拉非尼剂量增加,作用72小时后8505C和FTC133细胞的凋亡比例均上升,在10uM时分别高达22.9%和56.7%。



图1. 不同浓度索拉非尼作用不同时间对两种甲状腺癌细胞系存活率及凋亡的影响


  2 索拉非尼可以抑制MAPK及AKT/mTOR通路

  在8505C和FTC133细胞系中分别用2.5、5和10uM索拉非尼作用24小时,ERK(MAPK通路中重要分子)表达水平无明显变化,但是磷酸化的ERK在10uM条件下与对照组相比显著下降。类似地,用10uM索拉非尼作用24小时,可以显著抑制AKT和其重要下游分子p70s6k的磷酸化。



图2. 不同浓度索拉非尼作用24小时后,两种甲状腺癌细胞系(左8505C, 右FTC133, 下同)中MAPK及AKT/mTOR通路的激活情况


  3 抑制AKT通路可以促进甲状腺癌细胞凋亡,同时有助于索拉非尼发挥作用

  研究者通过siRNA干扰技术,使得AKT转录(mRNA水平)显著下降,磷酸化的AKT和p70s6k表达水平也显著下降。如图中所示,AKT-siRNA2的干扰最为有效。在此基础上加入索拉非尼,可以更加有效地降低这两种蛋白的磷酸化水平。

  此外,通过检测细胞存活率及凋亡情况,可以发现在两种细胞系中,抑制AKT通路同时应用索拉非尼可以显著促进细胞凋亡,降低细胞存活率,其效果比单用索拉非尼或单纯抑制AKT通路更胜一筹。



图3. 用siRNA干扰AKT通路情况下索拉非尼对两种甲状腺癌细胞系存活及凋亡的影响


  4 索拉非尼联合应用BEZ235可以显著提高抗甲状腺癌治疗效果

  BEZ235作为一种PI3K和mTOR抑制剂,可以有效抑制AKT通路。并且,实验结果证实,BEZ235与索拉非尼合用可以显著促进两种甲状腺癌细胞凋亡,疗效显著高于单用BEZ235和单用索拉非尼。



图4. AKT通路抑制剂BEZ235的效果及与索拉非尼联用对甲状腺癌细胞系凋亡的影响


  作者观点

  由于缺少有效的治疗方案,放射性碘难治的进展期DTC预后较差。索拉非尼作为重要治疗药物,其有效性受到耐药的限制,且具体耐药机制尚不明确。

  本研究提示索拉非尼可同时抑制MAPK和AKT/mTOR通路的活性,诱导甲状腺癌细胞凋亡、抑制其增殖过程;而联合应用BEZ235与索拉非尼可更有效的促进癌细胞凋亡并抑制其增殖,提示联合AKT/mTOR抑制剂或可作为索拉非尼的有效辅助手段。但具体的临床效果及药物可能的毒副作用仍需进一步研究。


  编译自:Yi H, Ye X, Long B, et al. Inhibition of the AKT/mTOR Pathway Augments the Anticancer Effects of Sorafenib in Thyroid Cancer. Cancer Biother Radiopharm. 2017, 32(5):176-183.




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